Western blot檢測(cè)技術(shù)

（一） 基本原理　免疫印跡又稱Western印跡（Western  blot），與DNA的Southern印跡技術(shù)相對(duì)應(yīng)，兩種技術(shù)均把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相載體（通常為NC膜），然后用探針檢測(cè)特異性組分。不同的是，Western blot所檢測(cè)的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。該技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測(cè)定特異敏感等諸多優(yōu)點(diǎn)，具有從復(fù)雜混合物中對(duì)特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測(cè)，以及從多克隆抗體中檢測(cè)出單克隆抗體的*性。該技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而無(wú)需對(duì)靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。

目前，Western blot廣泛用于蛋白質(zhì)研究、基礎(chǔ)研究和臨床醫(yī)學(xué)的研究。

（二） 基本方法　先將待檢測(cè)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （PAGE）分離各組分，然后通過(guò)印跡技術(shù)把分離樣品幾乎原位、定量轉(zhuǎn)移到NC膜上。隨后進(jìn)行類似間接ELISA法測(cè)抗原的反應(yīng)，即用特異抗體與NC膜上的靶抗原反應(yīng)，結(jié)合上的抗體可用與辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白進(jìn)行反應(yīng)，zui后通過(guò)與酶的底物發(fā)生顯色反應(yīng)來(lái)做檢測(cè)。

實(shí)際操作時(shí)，常把印跡后的NC膜分成兩部分，一部分如上所述做免疫檢測(cè)，另一部分直接進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，以便對(duì)轉(zhuǎn)移情況做直接觀察和判斷待測(cè)抗原所處位置及推算其分子量。

操作方法具體如下：

1.樣品的制備　樣品的制備方法的選擇取決于樣品的類型和待測(cè)抗原的性質(zhì)。細(xì)菌樣品一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解。哺乳動(dòng)物組織通?？蓹C(jī)械分散并直接溶于SDS凝膠加樣緩沖液。組織培養(yǎng)的單層細(xì)胞可用去污劑溫和裂解，也可直接在SDS凝膠加樣緩沖液中裂解。制備好的樣品用做SDS-PAGE分析。

2.蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析　PAGE過(guò)程有三種物理效應(yīng)可使樣品分離開(kāi)來(lái)，包括樣品的濃縮效應(yīng)、凝膠的分子篩效應(yīng)、一般電泳的電荷效應(yīng)。因此，樣品分離效果好，分辨力高。

而SDS-PAGE是將強(qiáng)陰子去污劑十二烷基磺酸鈉（SDS）與還原劑巰基乙醇并用，并通過(guò)加熱，使蛋白質(zhì)解離成多肽后再加樣于電泳凝膠上。由于各種SDS-多肽復(fù)合物均帶負(fù)電，且形狀近似，因此，該復(fù)合物在電場(chǎng)中的遷移率只取決于蛋白質(zhì)的大小，這樣通過(guò)SDS-PAGE可將不同大小的蛋白質(zhì)樣品分離開(kāi)來(lái)，借助已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)參照物，可推算出相應(yīng)的分子量。（三）將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上  操作方法如下：

（1） 剪6塊粗濾紙和一塊NC膜（大小應(yīng)與凝膠一致），并在轉(zhuǎn)移緩沖液（48 mmol/L Tris.HCl，39 mmol/L甘氨酸，0.037％SDS）中浸泡3-5分鐘。

（2） 將轉(zhuǎn)移電泳槽塑料支架平放，依次置放海綿、3塊濾紙、NC膜、凝膠及另外3塊濾紙和海綿，放置過(guò)程注意驅(qū)除夾層間氣泡。用支架夾緊上述各層，置電轉(zhuǎn)移槽中，NC膜一側(cè)靠正極，凝膠一側(cè)靠負(fù)極。

（3） 接通電源，40V、約1.轉(zhuǎn)移1.5-6小時(shí)。轉(zhuǎn)移時(shí)間長(zhǎng)短依靶蛋白分子量大小來(lái)調(diào)節(jié)。

（4） 轉(zhuǎn)移結(jié)束，取出NC膜做好上、下端標(biāo)記，切下一小條做蛋白質(zhì)染色處理，以檢查轉(zhuǎn)移效果。

（5） 將NC膜（WHATMAN 10401196）置干凈濾紙上，室溫自然干燥。

4.封閉　這一步處理的目的在于封閉NC膜上一些非特異性蛋白質(zhì)的潛在結(jié)合位點(diǎn)，以避免非特異性反應(yīng)。通常是在PBS緩沖液中加入1％脫脂奶粉或牛血清白蛋白配成封閉液，并將 NC膜浸泡其中，室溫封閉1小時(shí)左右。

5.（五）免疫檢測(cè)和顯色反應(yīng)　包括NC膜與*抗體、酶標(biāo)抗抗體（即第二抗體）反應(yīng)，以及用酶相應(yīng)的底物處理進(jìn)行顯色反應(yīng)。

（1） 將封閉好的NC膜浸入*抗體溶液中，抗體液依0.2ml/cm2調(diào)節(jié)用量，室溫或37℃溫和振蕩反應(yīng)1-2小時(shí)。

（2） 棄去抗體液，用PBS洗滌。

（3） 將NC膜浸入酶標(biāo)第二抗體反應(yīng)液，用量與一抗相同，37℃或室溫輕振蕩1-2小時(shí)。

（4） 棄二抗反應(yīng)液，PBS洗滌。

（5） 將膜放入相應(yīng)顯色液中，觀察顯色反應(yīng)。陽(yáng)性反應(yīng)將在靶蛋白相對(duì)應(yīng)的位置上出現(xiàn)有顏色的條帶，而其余位置無(wú)顯色條帶出現(xiàn)。

（三） 免疫印跡技術(shù)的應(yīng)用實(shí)例　用免疫印跡技術(shù)可定性、定量地檢測(cè)出待檢樣品中含量很低的特定病原體的抗原成分。對(duì)于一些能感染細(xì)胞而細(xì)胞病變不易觀察的病原體的檢測(cè)也很有用。用單克隆抗體做為*抗體進(jìn)行免疫印跡，還可以對(duì)毒株做分型研究。

1990年，西班牙等一些發(fā)現(xiàn)有非洲豬瘟的國(guó)家已將ELISA結(jié)合Western blot技術(shù)廣泛應(yīng)用于非洲豬瘟病毒（ASFV）抗體的檢測(cè)以幫助實(shí)施ASFV撲滅計(jì)劃。先用ELISA技術(shù)對(duì)大批血清樣品進(jìn)行初篩，隨后用Western blot技術(shù)對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)一步做驗(yàn)證，可有效排除假陽(yáng)性反應(yīng)。 1995年，Alcaraz.C等應(yīng)用基因工程技術(shù)成功建立了特異性更為理想的重組Western blot技術(shù)。他們用大腸桿菌系統(tǒng)克隆并表達(dá)了ASFV抗原性病毒結(jié)構(gòu)蛋白p54，將重組p54做為抗原建立了Western blot檢測(cè)技術(shù)。原有的Western blot技術(shù)所用的抗原是通過(guò)病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞而分離獲得，不可避免有細(xì)胞雜蛋白干擾。而應(yīng)用重組蛋白做為抗原，成分專一，可保證檢測(cè)結(jié)果的高度特異，還能避免將活毒應(yīng)用于檢測(cè)試驗(yàn)所可能帶來(lái)的散毒危險(xiǎn)。