Northern 和 Southern Blotting，以及 Colony 和 Plaque Lifts

Southern Blotting

直接比較三種帶正電尼龍膜在各自優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案下的表現(xiàn)：每種膜在其推薦的紫外波長照射下交聯(lián)。 Immobilon-Ny+ 轉(zhuǎn)印膜的雜交信號(hào)是其它兩種膜的 2 倍。

12 次重復(fù)雜交之后的信號(hào)強(qiáng)度

尼龍膜在 254 nm 交聯(lián)，并進(jìn)行了多次重復(fù)雜交，依次為：用 ³²P 標(biāo)記探針做 2 次雜交，4 次模擬雜交，用 ³²P 標(biāo)記探針做第 7 次雜交，然后進(jìn)行 5 次模擬雜交以及用 ³²P 標(biāo)記探針做第 13 次雜交。 在每個(gè)雜交周期之間，將膜置于 0.4M NaOH 溶液中，在 45°C 下洗提 30 分鐘。 模擬雜交與真實(shí)雜交*一樣，區(qū)別在于未加 ³²P 標(biāo)記探針。 在整個(gè)重復(fù)雜交過程中，Immobilon-Ny+ 的信號(hào)強(qiáng)度是競(jìng)爭產(chǎn)品 A 和 B 的兩倍。

檢測(cè)靈敏度

將凝膠上 DNA 的量減少到 0.01 ng。 0.1 lane（條帶）中的 2.2 和 2.0 kbp 帶分別與 DNA 的 0.48 和 0.42 pg 相對(duì)應(yīng)。 大約相當(dāng)于 10 µg 人類基因組 DNA 中一個(gè)單拷貝基因序列。 可通過對(duì)探針濃度加倍來提高靈敏度。 在 0.01 ng 條帶中，與競(jìng)爭產(chǎn)品 A 相比，Immobilon-Ny+ 轉(zhuǎn)印膜靈敏度稍高，而背景信號(hào)更低。

用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)進(jìn)行 Northern Blotting

鼠肝的全部 RNA （1 µg） 在甲醛瓊脂糖凝膠中電泳分離，然后通過毛細(xì)作用轉(zhuǎn)印到 Immobilon-Ny+ 轉(zhuǎn)印膜和競(jìng)爭產(chǎn)品帶正電尼龍膜 “A”。 與烘焙相比，通過紫外交聯(lián)固定RNA 能增強(qiáng)信號(hào)。 Immobilon-Ny+ 轉(zhuǎn)印膜比競(jìng)爭產(chǎn)品 A 表現(xiàn)出更高的靈敏度。

Colony Lifts

將載有 pUC19 或 pLH2（2.0 kbp λ 噬菌體 DNA Hind III 片段克隆至 pUC19）的 JM109 混合細(xì)菌懸浮液置于瓊脂培養(yǎng)皿中，在 37°C 下培養(yǎng)過夜。 將培養(yǎng)皿在 4°C 下冷卻30 分鐘，將菌落（直徑大約 1– 2 mm）轉(zhuǎn)印至一片 82 mm 直徑的 Immobilon-Ny+ 圓片膜上，或轉(zhuǎn)印至競(jìng)爭產(chǎn)品帶正電的尼龍膜上。 膜上的 DNA 在 254 nm， 60,000 µJoules/cm² 紫外光照射下 交聯(lián)。 然后用 a ³²P 標(biāo)記的 DNA 探針對(duì)膜進(jìn)行雜交，并使用磷屏成像系統(tǒng)顯色。